【摘要】 目的探讨糖心康对糖尿病心肌损伤的保护作用及机理。方法采用STZ加高脂饮食造模。治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃，以基因芯片技术TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果模型组细胞凋亡较正常组发生率明显增加，两组比较差异非常显著（P<0.01），而糖心康组心肌凋亡率则下降，模型组大鼠Fas基因蛋白表达增强，与正常组比较差异非常显著（P<0.01），而糖心康组Fas基因表达减弱，与模型组比较差异显著（P<0.01），模型组Bcl-2表达减弱，而糖心康组Bcl2表达较模型组增强，二者比较差异显著（P<0.01）。利用基因芯片技术在心肌基因表达谱中筛选出与细胞凋亡有关的促进与抑制因子基因主要有2个，即AF041376，M75720。 结论 糖心康有抑制心肌细胞凋亡作用，可使Fas基因、AF041376基因表达下调，使Bcl-2，M75720表达上调。这也是中药复方糖心康具有心肌损伤保护作用的机制之一。
【关键词】 糖心康 糖尿病 Fas基因 Bcl2基因 AF041376基因 M75720基因
Abstract：ObjectiveTo discuss the mechanism and protective effect of Tang-Xinkang against myocardial damage of diabetic mellitus rats.MethodsThe myocardial damage models of diabetic mellitus rats were created by STZ and high calorie feed. Treatment group rats were administered Tangxinkang while the control group and model group were given physiological saline. TUNEL method and gene chip technology were applied to examine myocardial apoptosis.ResultsThe occurrence rate of apoptotic cell increased more in the model group than the control group (P<0.01）, apoptotic cell was lower in the treatment group,while the expression of Fas was stronger in the model group. The difference was significant compared with the control group(P<0.01）. The expression of Fas was lower in the treatment group, the difference was significant compared with the model group(P<0.01）. The expression of Bcl-2 was lower in the model group,while the expression was stronger in the treatment group, the difference was significant between them(P<0.01）. Through adopting gene chip technology, we found two mainly promotive and inhibitory genes related to apoptosis in the Gene expression profiling, those were AF041376 and M75720 genes. ConclusionTang Xin-kang can restrain myocardial apoptosis, down-regulate the expression of Fas and AF041376,while up-regulate Bcl-2 and M75720.It is one of protective mechanisms of the Chinese compound.
Key words：TangXinkang； Diabetic mellitus； Fas gene； Bcl-2 gene； AF041376 gene； M75720 gene
细胞凋亡是近年分子生物学领域研究的热点之一，动物实验证实细胞凋亡在糖尿病心肌损伤病理演变过程中占重要地位，甚至在糖尿病心肌纤维化方面扮演重要角色。因此干预心肌细胞凋亡发生、调控与心肌细胞相关因子基因表达在糖尿病心肌损伤防治研究中具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和药品链脲佐菌素（STZ）为美国Sigma公司产品，糖心康为黑龙江中医药大学附属第一医院药厂制作。Bcl-2、Fas试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，原位末端标记检测试剂盒购自德国ROCHE-BM公司。有关芯片试剂及仪器设备，均为上海博星基因芯片公司备制。
1.2 动物造模及分组Wistar大鼠，雄性，体重200～230 g，除空白对照组外，余者以25 mg/kg STZ左下腹腔注射，造模成功后，随机分为模型组和治疗组。各组均喂以高热量饲料。
1.3 给药方法治疗组以中药糖心康灌胃，空白组及模型组以生理盐水灌胃。
1.4 标本采集快速用180℃，12 h处理过的手术剪刀摘取心脏，立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿心室长轴切取心肌，部分置于2.5%戊二醛及4%多聚甲醛固定，供光、电镜观察使用，部分置于液氮中冻存，以备提取RNA使用。
1.5 细胞凋亡检测⑴TUNEL法检测心肌细胞凋亡。具体步骤按试剂盒使用说明操作。阳性制定标准：以细胞核被染成棕褐色为阳性结果。⑵电镜超微形态学检测心肌凋亡，其特征是：细胞核染色质密度高并边集，核固缩畸变，核膜内陷，可见凋亡小体。⑶免疫组化法检测Bcl-2，Fas基因蛋白表达。具体方法按试剂盒说明操作。阳性判定标准：大部分胞浆弥漫性染成棕褐色为强阳性表达(+++)；部分胞浆染成淡棕黄色，部分胞浆不着色为弱阳性表达(+)，介于两者之间的为阳性表达（++）。
1.6 基因芯片检测⑴总RNA提取：一步抽提法。⑵探针标记与杂交。⑶筛选标准说明：根据总数为n的有效基因Cy3，Cy5的自然对数值InRi＝In cy5/cy3, 以Ri值 在0.1～10之间的有效基因作为均一化依据，算出这些基因cy5/cy3自然对数平均值In(R')，即均一化（Normalization）系数。将所有数据项的cy3标记强度乘上Normalize系数，得出调整后的cy3*。将所有cy3*小于200的强度值以200取代。算出所有基因调整后的Ratio值（cy5/cy3*）。筛选出Ratio值大于2或小于0.5的数据项列于工作表中。⑷不同RNA样本双色荧光标记叠加图（实验组/对照组）：图像处理软件：GenePix Pro 3.0；对于某一点的两种叠加荧光信号，如果cy3信号较强，该点多显绿色（下调趋势）；如果cy5信号较强，该点多显红色（上调趋势）； 如果强度相似，即显黄色。⑸不同心肌组织样本杂交信号强度散点图(实验组/对照组)：X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值(＝前景值－背景值)和 cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0之间，基本属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5～2.0范围之外(该点属于差异表达)。
2 结果
2.1 超微结构变化模型组细胞核异形变，核周边有切迹，固缩，染色质边集；而正常组及糖心康组未见细胞凋亡样改变。
2.2 心肌细胞凋亡的比较模型组细胞凋亡较正常组发生率明显增加，两组比较差异非常显著（P<0.01），而糖心康组心肌凋亡率则下降，说明糖心康有抑制心肌细胞凋亡作用。结果见表1。
2.3 心肌Fas基因表达水平变化模型组大鼠心肌损伤，可显著引发Fas基因蛋白表达增强，与正常组比较差异非常显著（P<0.01），而糖心康组Fas基因表达减弱，与模型组比较差异显著（P<0.01），提示糖心康有抑制Fas基因表达作用。结果见表2。
2.5 基因芯片的心肌基因表达谱情况筛选出Ratio值大于2或小于0.5的差异表达数据：数据2 304项。差异表达数据392项。双点均一异常表达基因124个。表达稳定的管家基因87个。其中与细胞凋亡有关的促进与抑制因子基因主要有2个，即AF041376，M75720。
